Методы исследования лекарственных субстанций

Клинические исследования лекарственных препаратов

Необходимость испытаний

Без клинических исследований нельзя предугадать, какое влияние окажет новый лекарственный препарат на организм человека.

Эксперименты на животных (доклинические исследования) позволяют сделать приблизительные выводы о воздействии лекарства. Вот почему исследования на людях становятся единственным способом получения доказательств безопасности и эффективности препарата.

Цель и задачи

Клиническое исследование лекарств – это научный эксперимент, проводимый на людях (добровольцах, пациентах) с целью установления лечебного эффекта и безопасности нового препарата или для расширения представления о существующем лекарстве.

Из цели вытекает ряд задач:

определить разовую, суточную, курсовую дозу препарата;

установить фармакокинетические показатели:

• способ введения вещества,
• скорость поступления из места введения в кровь,
• уровни концентрации в системном кровотоке, органе-мишени и тканях;
• период достижения максимальной концентрации,
• время и способ выведения из организма;

получить фармакодинамические показатели:

• механизм действия препарата и фармакологические эффекты,
• силу, длительность, вид воздействия вещества,
• реакцию организма на повторное введение,
• побочные реакции и осложнения,

составить перечень противопоказаний;

исследовать взаимодействие с иными лекарственными препаратами и пищевыми продуктами;

получить сравнительные показатели с существующими аналогичными препаратами.

Нормативно-правовая база

Временные рамки

На создание препарата, включая клинические испытания отводится, в среднем, больше 10 лет. В определённых обстоятельствах допускают ускоренную регистрацию препарата. Международные требования разрешают это в отношении препаратов, необходимых для лечения тяжёлых заболеваний, когда варианты терапии ограничены.

В России Министерство здравоохранения допускает ускоренную регистрацию препарата, если он нужен при возникновении и ликвидации чрезвычайной ситуации. В данном режиме были зарегистрированы лекарственные препараты для лечения коронавируса и вакцины с целью профилактики заражения.

Место проведения

Чаще всего заказчиком клинических исследований становится фармацевтическая компания. Она заинтересована в быстром наборе пациентов и в качественном эксперименте. Поэтому клиники и центры с высококвалифицированными специалистами и с большим количеством пациентов, подходящих под критерии включения в исследование, становятся предпочтительными при выборе места научной деятельности. Наибольшее количество испытаний проводится в крупных клиниках, в федеральных и региональных научно-исследовательских центрах, высших медицинских учебных заведениях. Часто фармацевтические компании обращаются за услугами по организации и проведению клинических испытаний к контрактным исследовательским организациям (КИО/CRO), обладающим квалифицированными сотрудниками и значительным опытом при проведении клинических и других видов медицинских исследований, например, наблюдательных (неинтервенционных) программ.

Участники

Клинические исследования осуществляются специалистами по клиническим исследованиям – научными сотрудниками, врачами, обладающих требуемыми квалификацией и опытом.

Цель исследования определяет критерии отбора участников. Выделяются категории, которым противопоказано испытание. Организатор исследований обязуется обеспечить добровольцев необходимой медицинской помощью.

Важный принцип клинических испытаний – добровольность.

Он реализуется двумя положениями:

• пациент имеет право отказаться от исследования в любой момент.
• участие пациента может быть только добровольным;

Второй фундаментальный принцип клинических исследований – процедура получения добровольного информированного согласия на участие в исследовании. Для этого существуют нормативные требования к перечню информации, которую необходимо донести до испытуемого. Информирование добровольца не должно пестрить множеством специальных терминов, затрудняющих восприятие информации. На время информирования отводится столько, сколько требуется для принятия обдуманного решения.

Человек узнаёт цель, задачи, сроки, особенности исследования, возможные последствия и т.п. д. Потенциальный участник письменно подтверждают факт ознакомления с информацией. Подпись, поставленная пациентом в информационном листке, является доказательством добровольного согласия на участие в клиническом исследовании.

Этапы исследования

Выделяется четыре фазы клинических испытаний. Каждая из них может оказаться последней в случае появления признаков опасности препарата для здоровья человека.

• 1 фаза – как правило, на малой группе здоровых людей (добровольцев). Обычно это 20 — 100 человек.
• 2 фаза — на более многочисленной группе пациентов без сопутствующих заболеваний.
• 3 фаза — на сотнях и тысячах больных с сопутствующими заболеваниями.
• 4 фаза — крупномасштабный мониторинг после того, как препарат прошёл регистрацию, получил одобрение и поступил в продажу.

Первая фаза

Приоритетная задача

Главная задача 1 фазы клинических испытаний состоит в подтверждении безопасности исследуемого препарата. Акцент ставится не на эффективность, а на безопасность. Исследователи оценивают переносимость препарата человеческим организмом и выявляют неопасную максимальную дозу вещества.

Участники

Это этап, сопряжённый с риском. Вот почему участники 1 фазы клинических исследований должны иметь крепкое здоровье. Только для таких проверка препарата сведёт к минимуму риск для здоровья. Десятки добровольцев отбираются и проходят полное обследование. Во время эксперимента они находятся под постоянным наблюдением врачей.

Процесс

Исследуемая субстанция предлагается добровольцам в различных дозах. Параллельно берутся анализы, делаются электрокардиографические, ультразвуковые и другие методы исследования.

Учёные получают ответы на ряд вопросов.

• как усваивается лекарство в организме;
• сколько времени циркулирует в крови;
• как быстро достигает органа-мишени;
• когда достигает максимальной концентрации;
• как быстро концентрация вещества в крови снижается;
• каким образом вещество выводится наружу;
• какой способ выведения – почечный или внепочечный – преобладает.

По фармакодинамике:

• каковы эффекты применения лекарственного вещества, то есть какое действие оказывается на клетки-мишени — подавляющее, стимулирующее, раздражающее, разрушающее, замещающее;
• каковы общая и другие виды токсичности;
• есть ли нежелательные реакции, какие, когда появляются.

Согласно протоколу исследования добровольцу сначала вводится низкая доза препарата. После тщательных наблюдений и обследований начинается процесс постепенного возрастания дозы. Увеличивается и период приёма лекарства. За испытуемым осуществляется непрерывное наблюдение. По многочисленным пробам устанавливается максимально допустимая доза.

Итог

По статистике около 50% препаратов из тех, которые проверяются на 1 стадии, оказываются токсичными или гипотоксичными для человека и по этой причине снимаются с дальнейших клинических исследований.

Если препарат подтвердил безопасность, начинается 2 фаза клинических исследований.

Вторая фаза

Участники

Для второй стадии клинических испытаний отбираются сотни человек со сходной патологией и без выявленных сопутствующих заболеваний. Различия по возрасту, полу, расе учитываются при формировании групп пациентов.

Набирая группу добровольцев, учёные стараются смоделировать заболевание в чистом виде. Пациенты должны иметь только интересующее исследователей заболевание. Тогда станет возможным оценить действие препарата по отношению к конкретному патологическому процессу.

Приоритетная задача

Данная фаза исследований не менее ответственна предыдущей. Безопасность лекарства доказана на здоровых людях. А какова будет реакция у человека с заболеванием?

Ставится новая задача — выявление безопасности и эффективности лекарственного средства на определённом контингенте больных.

Процесс

На данном этапе осуществляются исследования по подбору дозы препарата для достижения терапевтического эффекта: разовой, суточной, курсовой. Устанавливается кратность приёма. При испытании дозы многократно корректируются.

Также препарат должен доказать лечебный эффект в сравнении с плацебо (веществом, не имеющим активной субстанции).

Эффект плацебо состоит в том, что пациент может так понадеяться на лекарство, что самовнушение окажет положительное влияние на самочувствие, и результаты внушения ошибочно будут приняты за лекарственное воздействие. Вот почему помимо тестируемого препарата пациентам дают фиктивное лекарство (пустые таблетки, инъекции, мази).

Участники эксперимента подписывают документ, где соглашаются принимать препарат, не зная настоящий он или нет. Какой будет таблетка неизвестно даже врачу. Информацией владеет только организатор клинического исследования. Такой метод называется двойным слепым: о виде препарата не знает ни врач, ни пациент. Нужно исключить из анализа клинических испытаний субъективный фактор, способный исказить результаты.

Итог

Если эффективность и безопасность препарата на 2 фазе подтвердились, учёные получают разрешение на 3 стадию клинических исследований. До неё доходят единицы из заявленных лекарств.

Источник

Лекция 5. Методы анализа лекарственных веществ

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

Методы анализа лекарственных веществ.

Целью исследования лекарственных веществ является установление пригодности лекарственного средства для медицинского применения, т.е. соответствия его нормативному документу на данный препарат.

Фармацевтический анализ – это наука о химической характеристике и измерении биологически активных веществ на всех этапах производства: от контроля сырья до оценки качества полученного лекарственного вещества, изучения его стабильности, установления сроков годности и стандартизации готовой лекарственной формы. Особенностями фармацевтического анализа является его многогранность и многообразие веществ или их смесей, в том числе индивидуальные химические вещества, сложные смеси биологических веществ (белков, углеводом, олигопептидов и т.д.). Способы анализа нуждаются в постоянном совершенствовании и,если в УП фармакопее превалировали химические методы, в том числе качественные реакции, то на современном этапе используются преимущественно физико-химические и физические методы анализа.

Фармацевтический анализ в зависимости от поставленных задач включает различные аспекты контроля качества лекарств:
1. Фармакопейный анализ;
2. Постадийный контроль производства лекарственных средств;
3. Анализ лекарственных средств индивидуального изготовления.

Основным и наиболее существенным является фармакопейный анализ, т.е. анализ лекарственных средств на соответствие стандарту – фармакопейной статье или иному НД и, таким образом, подтверждение его пригодности. Отсюда и требования к высокой специфичности, селективности, точности и достоверности анализа.

Заключение о качестве лекарственного средства можно сделать только на основании анализа пробы (статистически достоверной выборки). Порядок отбора пробы указан либо в частной статье, либо в общей статье ГФ Х1 изд. (вып.2) с.15. Для проведения испытания лекарственных средств на соответствие требованиям нормативно-технической документации проводят многоступенчатый отбор проб (выборок). При многоступенчатом отборе пробу (выборку) образуют по ступеням и продукцию в каждой ступени отбирают случайным образом в пропорциональных количествах из единиц, отобранных в предыдущей ступени. Число ступеней определяется видом упаковки.

1 ступень: отбор единиц упаковочной тары (ящиков, коробок и т.д.);
2 ступень: отбор упаковочных единиц, находящихся в упаковочной таре (коробок, флаконов, банок и т.д.);
3 ступень: отбор продукции в первичной упаковке (ампул, флаконов, контурных упаковок и т.д.).

Для расчета отбора количества продукции на каждой ступени используют формулу:

0,4√n

где n – количество упаковочных единиц данной ступени.

Конкретный порядок формирования выборки подробно описан в ГФ Х1 издания, вып.2. При этом анализ считается достоверным при воспроизводимости как минимум четырех проб.

Критерии фармацевтического анализа

Для различных целей анализа имеют значения такие критерии как избирательность анализа, чувствительность, точность, время выполнения анализа, количество испытуемого вещества.

Избирательность анализа имеет существенное значение при анализе сложных препаратов, состоящих из нескольких действующих компонентов. В этом случае очень важна избирательность анализа для количественного определения каждого из веществ.

Требования к точности и чувствительности зависят от объекта и цели исследования. При испытании чистоты или примесей используют высокочувствительные методы. Для постадийного контроля производства важен фактор времени, затрачиваемый на анализ.

Важным параметром метода анализа является предел чувствительности метода. Этот предел означает наименьшее содержание, при котором можно достоверно обнаружить данное вещество. Наименее чувствительными являются химические методы анализа и качественные реакции. Самые чувствительные ферментные и биологические методы, позволяющие обнаруживать единичные макромолекулы веществ. Из реально применяемых самыми чувствительными являются радиохимический, каталитический и флуоресцентный методы, позволяющие определять до 10 -9 %; чувствительность спектрофотометрических методов 10 -3 -10 -6 %; потенциометрических 10 -2 %.

Термин «точность анализа» включает одновременно два понятия: воспроизводимость и правильность полученных результатов.

Воспроизводимость –характеризует рассеяние результатов анализа по сравнению со средним значением.

Правильность – отражает разность между действительным и найденным содержанием вещества. Точность анализа зависит от качества приборов, опытности аналитика и т.д. Точность анализа не может быть выше, чем точность наименее точного измерения. Это означает, что если при титровании точность составляет ±0,2 мл плюс ошибка от натекания тоже ±0,2 мл, т.е. суммарно ±0,4 мл то при расходовании 20 мл титранта ошибка составляет 0,2%. При уменьшении навески и количества титранта точность уменьшается. Таким образом титриметрический анализ позволяет выполнять определение с относительной погрешностью ± (0,2-0,3)%. Каждый из методов имеет свою точность. При анализе важно иметь представление о следующих понятиях:

Грубые ошибки- являются просчетом наблюдателя или нарушения методики анализа. Такие результаты отбрасываются как недостоверные.

Систематические ошибки – отражают правильность результатов анализа. Они искажают результаты измерений, как правило, в одну сторону на некоторое постоянное значение. Систематические ошибки можно частично устранить введением поправок, калибровкой прибора и т.д.

Случайные ошибки – отражают воспроизводимость результатов анализа. Они вызываются неконтролируемыми переменными. Среднее арифметические случайных ошибок стремится к нулю. Поэтому для расчетов необходимо использовать не результаты единичных измерений, а среднее из нескольких параллельных определений.

Абсолютная ошибка –представляет собой разность между полученным результатом и истинным значением. Эта ошибка выражается в тех же единицах, что и определяемая величина.

Относительная ошибка определения равна отношению абсолютной ошибки к истинному значению определяемой величины. Выражают ее обычно в процентах или долях.

Значения относительных ошибок находятся в зависимости от того каким методом выполняют анализ и что из себя представляет анализируемое вещество – индивидуальное вещество и смесь многих компонентов.

Относительная ошибка при исследованиях индивидуальных веществ спектрофотометрическим методом составляет 2-3 %, ИК-спектрофотометрией – 5-12%; жидкостной хроматографией 3-4%; потенциометрией 0,3-1%. Сочетанные методы как правило снижают точность анализа. Наименее точными являются биологические методы – их относительная ошибка достигает 50%.

Методы идентификации лекарственных веществ.

Важнейшим показателем при испытании лекарственных веществ является их идентификация или как это принято в фармакопейных статьях подлинность. Для определения подлинности лекарственных веществ используют многочисленные методы. Все основные и общие описаны в ГФ Х1 издания, вып.1. Исторически основной упор делался на химические, в т.ч. качественные цветные реакции, характеризующие наличие определенных ионов или функциональных групп у органических соединений, одновременно с этим широко использовались и физические методы. В современных фармакопеях упор делается на физико-химические методы.

Остановимся на основных физических методах.

Достаточно стабильной константой, характеризующей вещество, его чистоту и подлинность является температура плавления. Этот показатель широко используется для стандартизации субстанций лекарственных веществ. Подробно методы определения температуры плавления описаны в ГФ Х1, самостоятельно вы смогли опробовать его на лабораторных занятиях. Чистое вещество имеет постоянную температуру плавления, однако при добавлении в него примесей температура плавления как правило снижается весьма существенно. Такой эффект называют пробой смешения и именно проба смешения позволяет устанавливать подлинность препарата при наличии стандартного образца или заведомой пробы. Бывают, правда и исключения, так рацемическая сульфокамфорная кислота плавится при более высокой температуре, а различные кристаллические формы индометацина отличаются температурой плавления. Т.е. данный метод является одним из показателей, позволяющих характеризовать как чистоту продукта, так и его подлинность.

Для некоторых препаратов используют такой показатель как температура затвердевания. Другим показателем, характеризую-щим вещество является температура кипения или температурные пределы перегонки. Этим показателем характеризуют жидкие вещества, например, спирт этиловый. Температура кипения менее характеристичный показатель, он сильно зависит от давления атмосферы, возможности образования смесей или азеотропов и применяется достаточно редко.

Среди других физических методов следует отметить определение плотности, вязкости. Стандартные методики анализа описаны в ГФ Х1. Методом, характеризующим подлинность препарата является также определение растворимости его в различных растворителях. По ГФ Х1 изд. Этот метод характеризуется как свойство, которое может служить ориентировочной характеристикой испытуемого препарата. Наряду с температурой плавления растворимость вещества является одним из параметров, по которому устанавливают подлинность и чистоту практически всех лекарственных веществ. В фармакопее установлена ориентировочная градация веществ по растворимости от очень легко растворим до практически не растворим. При этом растворившимся считается вещество, в растворе которого в проходящем свете не наблюдается частиц вещества.

Физико-химические методы определения подлинности.

Наиболее информативными с точки зрения определения подлинности веществ являются физико-химические методы, основанные на свойствах молекул веществ взаимодействовать с какими-либо физическими факторами. К физико-химическим методам следует отнести:

1.Спектральные методы
УФ-спектроскопия
Спектроскопия в видимом свете
ИК-спектроскопия
Флуоресцентная спектроскопия
Атомно-абсорбционная спектроскопия
Рентгеновские методы анализа
Ядерный магнитный резонанс
Рентгеноструктурный анализ

2.Сорбционные методы анализа
Тонкослойная хроматография
Газожидкостная хроматография
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Элетрофорез
Ионофорез
Гель-хроматография

3.Массовые методы анализа
Масс-спектрометрия
Хроматомассспектрометрия

4.Электрохимические методы анализа
Полярография
Электронный парамагнитный резонанс

5.Использование стандартных образцов

Рассмотрим вкратце применимые в фармации из методов анализа. Подробно все эти методы анализа вам будут прочитаны в конце декабря профессором Мягких В.И. Для определения подлинности лекарственных веществ используют некоторые спектральные методы. Наиболее достоверным является использование низкочастотной области ИК спектроскопии, где полосы поглощения наиболее достоверно отображают данное вещество. Еще эту область называю область отпечатков пальцев. Как правило, для подтверждения подлинности используют сравнение ИК-спектров, снятых в стандартных условиях стандартного образца и испытуемого образца. Совпадение всех полос поглощения подтверждает подлинность препарата. Использование УФ и видимой спектроскопии менее достоверно, т.к. характер спектра не является индивидуальным и отражает только определенный хромофор в структуре органического соединения. Атомно-абсорбционная спектроскопия и рентгеновская спектроскопия используются для анализа неорганических соединений, для идентификации химических элементов. Ядерный магнитный резонанс позволяет устанавливать структуру органических соединений и является достоверным методом подтверждения подлинности, однако в силу сложности приборов и дороговизны используется очень редко и, как правило, только в исследовательских целях. Флуоресцентная спектроскопия применима только для определенного класса веществ, флуоресцирующих под действием УФ излучения. При этом спектр флуоресценции и спектр возбуждения флуоресценции достаточно индивидуальны, но сильно зависят от среды, в которой растворено данное вещество. Этот метод чаще используют для количественного определения, особенно малых количеств, поскольку он является одним из наиболее чувствительных.

Рентгеноструктурный анализ является наиболее достоверным методом подтверждения структуры вещества, он позволяет установить точную химическую структуру вещества, однако для поточного анализа подлинности просто не пригоден и используется исключительно в научных целях.

Сорбционные методы анализа нашли очень широкое применение в фармацевтическом анализе. Они используются для определения подлинности, наличия примесей и количественного определения. Подробно об этих методах и используемой аппаратуре вам будет прочитана лекция профессором В.И.Мягких – региональным представителем фирмы Шимадзу – одного из главных производителей хроматографического оборудования. Эти методы основаны на принципе сорбции-десорбции веществ на определенных носителях в потоке носителя. В зависимости от носителя и сорбента подразделяют на тонкослойную хроматографию, жидкостную колоночную (аналитическую и препаративную, в том числе ВЭЖХ), газожидкостную хроматографию, гель фильтрацию, ионофорез. Два последних метода применяются для анализа сложных белковых объектов. Существенным недостатком методов является их относительность, т.е. хроматография может характеризовать вещество и его количество только при сравнении со стандартным веществом. Однако следует отметить как существенное достоинство – высокая достоверность метода и точность, т.к. в хроматографии любая смесь должна разделиться на индивидуальные вещества и результатом анализа является именно индивидуальное вещество.

Масс-спектрометрические и электрохимические методы используют для подтверждения подлинности редко.

Особое место занимают методы определения подлинности в сравнении со стандартным образцом. Этот метод используют достаточно широко в зарубежных фармакопеях для определения подлинности сложных макромолекул, сложных антибиотиков, некоторых витамином, и других веществ, содержащих особенно хиральные атомы углерода, поскольку определить подлинность оптически активного вещества другими методами сложно или вовсе невозможно. Стандартный образец должен разрабатывать и выпускаться на основании разработанной и утвержденной фармакопейной статьи. В России существуют и применяются всего несколько стандартных образцов и для анализа используют чаще всего так называемые РСО – рабочие стандартные образцы, приготавливаемые непосредственно перед опытом из заведомых субстанций или соответствующих веществ.

Химические методы установления подлинности.

Установление подлинности лекарственных веществ химическими методами используется главным образом для неорганических лекарственных веществ, т.к. иных методов чаще всего нет или они требуют сложной и дорогой аппаратуры. Как уже говорилось неорганические элементы легко идентифицируются методами атомно-абсорбционной или рентгеновской спектроскопии. В наших Фармакопейных статьях обычно используются химические методы установления подлинности. Эти методы принято делить на следующие:

Реакции осаждения анионов и катионов. Типичными примерами являются реакции осаждения ионов натрия и калия с (цинкуранилацетатом и винной кислотой) соответственно:

Таких реакций используется великое множество и они будут подробно обсуждаться в специальном разделе фармацевтической химии в части неорганических веществ.

Окислительно-восстановительные реакции.

Окислительно-восстановительные реакции используют для восстановления металлов из оксидов. Например серебра из его окиси формалинов ( реакция серебряного зеркала):

реакция окисления дифениламина лежит в основе испытаний подлинности нитратов и нитритов:

Реакции нейтрализации и разложения анионов.

Карбонаты и гидрокарбонаты под действием минеральных кислот образуют угольную кислоту, которая разлагается до двуокиси углерода:

Аналогично разлагаются нитриты, тиосульфаты, аммониевые соли.

Изменения окраски бесцветного пламени. Соли натрия окрашивают пламя в желтый цвет, меди зеленый, калия в фиолетовый, кальция в кирпично-красный. Именно этот принцип использован в атомно-абсорбционной спектроскопии.

Разложение веществ при пиролизе. Метод используют для препаратов йода, мышьяка, ртути. Из используемых в настоящее время наиболее характерна реакция основного нитрата висмута, который при нагревании разлагается с образованием окислов азота:

Идентификация элементоорганических лекарственных веществ.

Качественный элементный анализ используют для идентификации соединений, содержащих в органической молекуле мышьяк, серу, висмут, ртуть, фосфор, галогены. Поскольку атомы этих элементов не ионизированы для их идентификации используют предварительную минерализацию, либо пиролизом, либо опять-таки пиролизом с серной кислотой. Серу определяют по сероводороду реакцией с нитропруссидом калия или солей свинца. Йод также определяют пиролизом по выделению элементарного йода. Из всех этих реакций интерес представляет идентификация мышьяка, не столько как лекарственного препарата – они практически не используются, а как метод контроля примесей, но об этом позже.

Испытания подлинности органических лекарственных веществ. Химические реакции, используемые для испытаний подлинности органических лекарственных веществ, можно разделить на три основных группы:
1.Общие химические реакции органических соединений;
2.Реакции образования солей и комплексных соединений;
3.Реакции используемые для идентификации органических оснований и их солей.

Все эти реакции в конечном итоге основаны на принципах функционального анализа, т.е. реакционно-способного центра молекулы, который вступая в реакцию дает соответствующий ответ. Чаще всего это изменение каких-либо свойств вещества: цвета, растворимости, агрегатного состояния и т.д.

Рассмотрим некоторые примеры использования химических реакций для идентификации лекарственных веществ.

1. Реакции нитрования и нитрозирования. Используются достаточно редко, например, для идентификации фенобарбитала, фенацетина, дикаина, правда препараты эти почти не используются в медицинской практике.

2. Реакции диазотирования и азосочетания. Эти реакции используют для открывания первичных аминов. Диазотированный амин сочетается с бэта-нафтолом, давая характерное красное или оранжевое окрашивание.

3. Реакции галогенирования. Используют для открытия алифатических двойных связей – при добавлении бромной воды идет присоединение брома по двойной связи и раствор обесцвечивается. Характерная реакция анилина и фенола – при их обработке бромной водой образуется трибромпроизводное, выпадающее в осадок.

4. Реакции конденсации карбонильных соединений. Реакция заключается в конденсации альдегидов и кетонов с первичными аминами, гидроксиламином, гидразинами и семикарбазидом:

Образующиеся азометины (или Шиффовы основания) имеют характерный желтый цвет. Реакцию используют для идентификации ,например сульфониламидов. В качестве альдегида используют 4-диметиламинобензальдегид.

5. Реакции окислительной конденсации. Процесс окислительного расщепления и образования азометинового красителя лежит в основе нингидриновой реакции. Эту реакцию широко используют для открытия и фотоколориметрического определения α- и β-аминокислот, в присутствии которых появляется интенсивная темно-синяя окраска. Она обусловлена образованием замещенной соли дикетогидриндилидендикетогидрамина – продукта конденсации избытка нингидрина и восстановленного нингидрина с аммиаком, выделившимся при окислении испытуемой аминокислоты:

Для открытия фенолов используют реакцию образования триарилметановых красителей. Так фенолы взаимодействуя с формальдегидом образуют красители. К аналогичным реакциям можно отнести взаимодействие резорцина с фталевым ангидридом приводящим к образованию флуоресцентного красителя – флуоресцеина.

Используются также и многие другие реакции.

Особый интерес представляют реакции с образованием солей и комплексов. Неорганические соли железа (III), меди (II), серебра, кобальта, ртути (II) и другие для испытания подлинности органических соединений: карбоновых кислот, в том числе аминокислот, производных барбитуровой кислоты, фенолов, сульфониламидов, некоторых алкалоидов. Образование солей и комплексных соединений происходит по общей схеме:

R-COOH + MX = R-COOM + HX

Аналогично протекает комплексообразование аминов:

Одним из наиболее распространенных реактивов в фармацевтическом анализе является раствор хлорида железа (III). Взаимодействия с фенолами он образует окрашенный раствор феноксидов, они окрашены в синий или фиолетовый цвет. Такая реакция используется для открытия фенола или резорцина. Однако мета-замещенные фенолы не образуют окрашенных соединений (тимол).

Соли меди образуют комплексные соединения с сульфониламидами, соли кобальта с барбитуратами. Многие эти реакции используют и для количественного определения.

Идентификация органических оснований и их солей. Эта группа методов чаще всего используется в готовых формах, особенно при исследованиях растворов. Так соли органических аминов при добавлении щелочей образуют осадок основания (например, раствор папаверина гидрохлорида) и наоборот соли органических кислот при добавлении минеральной кислоты дают осадок органического соединения (например, салицилат натрия). Для идентификации органических оснований и их солей широко используют так называемые осадительные реактивы. Известно более 200 осадительных реактивов, которые образуют с органическими соединениями нерастворимые в воде простые или комплексные соли. Наиболее употребительные растворы приводятся во втором томе ГФ 11 издания. В качестве примера можно привести:
Реактив Шейблера – фосфорновольфрамовая кислота;
Пикриновая кислота
Стифниновая кислота
Пикраминовая кислота

Все эти реактивы используются для осаждения органических оснований (к примеру, нитроксолин).

Следует отметить, что все эти химические реакции используются для идентификации лекарственных веществ не сами по себе, а в комплексе с другими методами, чаще всего физико-химическими, такими как хроматография, спектроскопия. Вообще необходимо обратить внимание, что проблема подлинности лекарственных веществ является ключевой, т.к. этот факт определяет безвредность, безопасность и эффективность лекарственного средства, поэтому такому показателю необходимо уделять большое внимание и подтвердить подлинность вещества одним методом недостаточно.

Общие требования к испытаниям на чистоту.

Другим не менее важным показателем качества лекарственного средства является чистота. Все лекарственные препараты, независимо от способа их получения испытывают на чистоту. При этом устанавливается содержание примесей в препарате. Условно можно разделить примеси на две группы: первая, примеси, оказывающие фармакологическое действие на организм; вторая, примеси, указывающие на степень очистки вещества. Последние не влияют на качество препарата, но в больших количествах снижают его дозу и соответственно уменьшают активность препарата. Поэтому все фармакопеи устанавливают определенные пределы этих примесей в лекарственных препаратах. Таким образом, основной критерий доброкачественности препарата – отсутствие примесей, что невозможно по природе. Понятие отсутствие примесей связано с пределом обнаружения тем или иным методов.

Физические и химические свойства веществ и их растворов дают ориентировочное представление о наличии примесей в лекарственных препаратах и регламентируют их пригодность для использования. Поэтому, чтобы оценить доброкачественность, наряду с установлением подлинности и определением количественного содержания, проводят целый ряд физических и химических испытаний, подтверждающих степень его чистоты:

Прозрачность и степень мутности проводится путем сравнения с эталоном мутности, а прозрачность определяется путем сравнения с растворителем.

Цветность. Изменение степени цветности может быть обусловлено:
а) наличием посторонней окрашенной примеси;
б) химическим изменением самого вещества (окисление, взаимодействие с Ме +3 и +2 или другие химические процессы, протекающие с образованием окрашенных продуктов. Например:

Резорцин желтеет при хранении за счет окисления под действием кислорода воздуха с образованием хинонов. При наличии, например, солей железа салициловая кислота приобретает фиолетовый цвет вследствие образования салицилатов железа.

Оценка цветности проводится по результатам сравнения основного опыта с эталонами цветности, а бесцветность определяют путем сравнения с растворителем.

Очень часто используют для обнаружения примесей органических веществ испытание, основанное на их взаимодействии с концентрированной серной кислотой, которая при этом может выступать в роли окислителя или дегидратирующего средства. В результате таких реакций образуются окрашенные продукты, Интенсивность полученной окраски не должна превышать соответствующего эталона цветности.

Определение степени белизны порошкообразных лекарственных средств – физический метод, впервые включенный в ГФ Х1. Степень белизны (оттенка) твердых лекарственных веществ можно оценивать различными инструментальными методами на основе спектральной характеристики света отраженного от образца. Для этого применяют коэффициенты отражения при освещении образца белым светом, полученным от специального источника, со спектральным распределением или пропущенным через светофильтры ( с мах пропускания 614 нм (красный) или 439 нм (синий)). Можно также измерять коэффициент отражения света, пропущенного через зеленый светофильтр.

Более точно оценку белизны лекарственных веществ можно осуществлять с помощью спектрофотометров отражения. Значение степени белизны и степени яркости являются характеристиками качества белых и белых с оттенками лекарственных веществ. Их допустимые пределы регламентируются в частных статьях.

Определение кислотности, щелочности, рН.

Изменение этих показателей обусловлено:
а) изменением химической структуры самого лекарственного вещества:

б) взаимодействием препарата с тарой, например, превышение допустимых пределов щелочности в растворе новокаина за счет выщелачивания стекла;
в) поглощнием газообразных продуктов (СО₂, NН₃) из атмосферы.

Определение качества лекарственных средств по этим показателям осуществляется несколькими способами:

а) по изменению окраски индикатора, например, примесь минеральных кислот в кислоте борной определяется по метиловому красному, который не изменяет своей окраски от действия слабой борной кислоты, но розовеет в случае наличия в ней примесей минеральных кислот.

б) титриметрический метод – например, для установления допустимого предела содержания йодоводородной кислоты, образующейся при хранении 10% спиртового раствора I₂, проводят титрование щелочью ( не более 0,3 мл 0,1 моль/л NаОН по объему титранта). (Раствор формальдегида – титруют щелочью в присутствии фенолфталеина).

В ряде случаев ГФ устанавливает объем титранта для определения кислотности или щелочности.

Иногда проводят последовательное прибавление двух титрованных растворов: вначале кислоты и затем щелочи.

в) путем определения значения величины рН – для ряда лекарственных средств (и обязательно для всех инъекционных растворов) по НТД предусматривается определять величины рН.

Приемы подготовки вещества при исследовании кислотности, щелочности, рН

1. Приготовление раствора определенной концентрации, указанной в НТД ( для веществ, растворимых в воде)
2. Для нерастворимых в воде – готовят взвесь определенной концентрации и определяют кислотно-щелочные свойства фильтрата.
3. Для жидких препаратов, не смешивающихся с водой, проводят взбалтывание с водой, затем отделяют водный слой и определяют его кислотно-щелочные свойства.
4. Для нерастворимых твердых и жидких веществ определение можно проводить непосредственно во взвеси (ZnO)

Значение рН ориентировочно ( до 0,3 ед) можно определять с помощью индикаторной бумаги или универсального индикатора.

Колориметрический способ основан на свойстве индикаторов изменять свою окраску при определенных интервалах значений рН среды. Для выполнения испытаний используют буферные растворы с постоянной концентрацией водородных ионов, отличающихся друг от друга на величину рН, равную 0,2 . К серии таких растворов и к испытуемому раствору прибавляют одинаковое количество (2-3 капли) индикатора. По совпадению окраски с одним из буферных растворов судят о значении рН среды испытуемого раствора.

Определение летучих веществ и воды.

Летучие вещества могут попасть в лекарственные средства либо вследствие плохой очистки от растворителей или промежуточных продуктов получения, либо в результате накопления продуктов разложения. Вода в лекарственном веществе может содержаться в виде капиллярной, абсорбировано связанной, химически связанной (гидратно- и кристаллогидратной) или свободной.

Для определения летучих веществ и воды используют методы высушивания, дистилляции и титрование раствором Фишера.

Метод высушивания. Метод применяют для определения потери в массе при высушивании. Потери могут быть за счет содержания в веществе гигроскопической влаги и летучих веществ. Сушат в бюксе до постоянной массы при определенной температуре. Чаще вещество выдерживают при температуре 100-105 ºС, но условия высушивания и доведения до постоянной массы могут быть и иными.

Определение летучих веществ может проводиться для некоторых средств методом прокаливания. Вещество нагревают в тигле до полного удаления летучих веществ. затем постепенно повышают температуру до полного прокаливания при красном калении. Например, ГФХ регламентирует определение примеси карбоната натрия в лекарственном веществе натрия гидрокарбонат методом прокаливания. Натрия гидрокарбонат разлагается при этом на карбонат натрия, диоксид углерода и воду:

Теоретически потеря в массе составляет 36,9 %. По ГФХ потеря в массе должна быть не менее 36,6%. Разница между теоретической и указанной в ГФХ потерей в массе определяет допустимый предел примеси карбоната натрия в веществе.

Метод дистилляции в ГФ 11 называется «Определение воды», он позволяет определить воду гигроскопическую. Этот метод основан на физическом свойстве паров двух несмешивающихся жидкостей. Смесь воды с органическим растворителем перегоняется при более низкой температуре, чем каждая из этих жидкостей . В качестве органического растворителя ГФХ1 рекомендует использовать толуол или ксилол. Содержание воды в испытуемом веществе устанавливают по объему ее в приемнике после окончания процесса перегонки.

Титрование реактивом Фишера. Метод позволяет определять суммарное содержание как свободной, так и кристаллогидратной воды в органических, неорганических веществах, растворителях. Преимущество этого метода – быстрота выполнения и селективность по отношению к воде. Раствор Фишера представляет собой раствор диоксида серы, йода и пиридина в метаноле. К числу недостатков метода, помимо необходимости строгого соблюдения герметичности, относится невозможность определения воды в присутствии веществ, которые реагируют с компонентами реактива.

Определение золы.

Зольность обусловлена минеральными примесями, которые появляются в органических веществах в процессе получения из исходных продуктов вспомогательных материалов и аппаратуры (прежде всего катионов металлов), т.е. характеризует наличие неорганических примесей в органических веществах.

а) Общая зола – определяется по результатам сжигания (озоления, минерализации) при высокой температуре, характеризует сумму всех неорганических веществ-примесей.

При получении лекарственных средств из растительного сырья минеральные примеси могут быть обусловлены загрязнениями растений пылью, поглощением микроэлементов и неорганических соединений из почвы, воды и т.д.

б) Зола, нерастворимая в хлороводородной кислоте, получают после обработки общей золы разбавленной НСl. Химический состав золы – хлориды тяжелых металлов (АgCl, НgСl₂, Нg₂Сl₂), т.е. высокотоксичные примеси.

в) Сульфатная зола – Сульфатную золу определяют при оценке доброкачественности многих органических веществ. Характеризует примеси Мn +n в стабильной сульфатной форме. Образовавшаяся сульфатная зола (Fе₃(SО₄)₂, РbSО₄, СаSО₄) используется для последующего определения примеси тяжелых металлов.

Примеси неорганических ионов – С1 – , SО₄ -2 , NН₄ + , Са +2 , Fе +3(+2) , Рв +2 , Аs +3(+5)

Недопустимые примеси:
а) примеси, имеющие токсический характер (примесь СN – в йоде),
б) обладающие антагонистическим действием (Nа и К, Мg и Са)

Отсутствие примесей, не допускаемых в лекарственном веществе, устанавливают по отрицательной реакции с соответствующими реактивами. Сравнение в этом случае проводится с частью раствора, к которому добавлены все реактивы, кроме основного открывающего данную примесь (контрольный опыт). Положительная реакция говорит о наличии примеси и о недоброкачественности лекарственного средства.

Допустимые примеси – примеси, не оказывающие влияния на фармакологический эффект и содержание которых допускается в незначительных количествах, установленных НТД.

Для установления допустимого предела содержания примесей ионов в лекарственных средствах используются эталонные растворы, которые содержат соответствующий ион в определенной концентрации.

Некоторые лекарственные вещества испытывают на наличие примеси методом титрования, например, определение примеси норсульфазола в лекарственном средстве фталазол. Примесь норсульфазола во фталазоле устанавливают количественно нитритометрически. На титрование 1 г фталазола должно расходоваться не более 0,2 мл 0,1 моль/л NaNО₂.

Общие требования к реакциям, которые используются при испытаниях на допустимые и недопустимые примеси:
1. чувствительность,
2. специфичность,
3. воспроизводимость используемой реакции.

Результаты реакций, протекающих с образованием цветных продуктов, наблюдают в отраженном свете на матовобелом фоне, а белые осадки в виде мути и опалесценции – в проходящем свете на черном фоне.

Приборные методы определения примесей.

С развитием методов анализа постоянно повышаются требования к чистоте лекарственных веществ и лекарственных форм. В современных фармакопеях наряду с рассмотренными методами используются и различные приборные методы, основанные на физико-химических, химических и физических свойствах веществ. Использование УФ и видимой спектроскопии редко дает положительные результаты и обусловлено это тем, что строение примесей, особенно органических лекарств, как правило. Близко к строению и самого лекарства, поэтому спектры поглощения различаются мало, а концентрация примеси обычно в десятки раз ниже, чем основного вещества, что делает дифференциальные методы анализа малопригодными и позволяет оценить примесь только ориентировочно, т.е как принято называть полуколичественно. Несколько лучше бывают результаты, если одно из веществ, особенно, примесь образует комплексное соединение, а другое нет, тогда максимумы спектров существенно различаются и уже можно определять примеси количественно.

В последние годы на предприятиях появились приборы ИК-Фурье, позволяющие определять как содержание основного вещества, так и примесей, особенно воды без разрушения образца, однако их применение сдерживается дороговизной приборов и отсутствием стандартизированных методик анализа.

Отличные результаты определения примесей возможны тогда, когда примесь флуоресцирует под действием УФ излучение. Точность таких анализов очень высока, также как и их чувствительность.

Широкое применение для испытаний на чистоту и количественное определение примесей как в лекарственных вещества (субстанциях), так и в лекарственных формах, что, пожалуй, не менее важно, т.к. многие примеси образуются в процессе хранения лекарств, получили хроматографические методы: ВЭЖХ, ТСХ, ГЖХ.

Эти методы позволяют определять примеси количественно, причем каждую из примесей индивидуально в отличие от других методов. Подробно методы хроматографии ВЭЖХ и ГЖХ будут рассмотрены в лекции проф. Мягких В.И. Мы остановимся только на тонкослойной хроматографии. Метод тонкослойной хроматографии был открыт русским ученым Цветом и в начале существовал как хроматография на бумаге. Тонкослойная хроматография (ТСХ) основана на различии скоростей перемещения компонентов анализируемой смеси в плоском тонком слое сорбента при движении по нему растворителя (элюента). Сорбентами служат силикагель, окись алюминия, целлюлоза. Полиамид, элюентами – органические растворители разной полярности или их смеси между собой и иногда с растворами кислот или щелочей и солей. Механизм разделения обусловлен коэффициентами распределения между сорбентом и жидкой фазой исследуемого вещества, что в свою очередь связано со многими, в том числе химическими и физико-химическими свойствами веществ.

В ТСХ поверхность пластинки алюминиевой или стеклянной покрывают суспензией сорбента, высушивают на воздухе и активируют для удаления следов растворителя (влаги). В практике используют обычно пластины промышленного изготовления с закрепленным слоем сорбента. На слой сорбента наносят капли анализируемого раствора объемом 1-10 мкл. Край пластины погружают в растворитель. Эксперимент проводят в специальной камере – стеклянном сосуде, закрытом крышкой. Растворитель перемещается по слою под действием капиллярных сил. Возможно одновременное разделение нескольких различных смесей. Для увеличения эффективности разделения используют многократное элюирование или в перпендикулярном направлении тем же или другим элюентом.

После завершения процесса пластинку высушивают на воздухе и устанавливают положение хроматографических зон компонентов различными способами, например, облучением УФ-излучением, опрыскиванием окрашивающими реагентами, выдерживают в парах йода. На полученной картине распределения (хроматограмме) хроматографические зоны компонентов смеси располагаются в виде пятен в соответствии с их сорбируемостью в данной системе.

Положение хроматографических зон на хроматограмме характеризуют величиной R_f . которая равна отношению пути l_i, пройденному і-тым компонентом от точки старта, к пути Vп R_f = l_i/ l.

Величина R_f зависит от коэффициента распределения (адсорбции) К_і и соотношения объемов подвижной (V_п) и неподвижной (V_н) фаз.

На разделение в ТСХ влияет ряд факторов – состав и свойства элюента, природа, дисперсность и пористость сорбента, температура, влажность, размеры и толщина слоя сорбента и размеры камеры. Стандартизация условий эксперимента позволяет устанавливать R_f с относительным стандартным отклонением 0,03.

Идентификацию компонентов смеси проводят по величинам R_f. Количественное определение веществ в зонах можно осуществлять непосредственно на слое сорбента по площади хроматографической зоны, интенсивности флуоресценции компонента или его соединения с подходящим реагентом, радиохимическими методами. Используют также автоматические сканирующие приборы, измеряющие поглощение, пропускание, отражение света или радиоактивность хроматографических зон. Разделенные зоны можно снять с пластины вместе со слоем сорбента, десорбировать компонент в растворитель и анализировать раствор спектрофотометрически. С помощью ТСХ можно определить вещества в количествах от 10 -9 до 10 -6 ; ошибка определения не менее 5-10%.

Источник