Методы хроматографического анализа лекарственных средств

Хроматография в медицине: классификация, применение, перспективы

Хроматография – метод разделения и анализа сложных молекулярных соединений и их смесей, основанный на принципе сорбции. Анализируемое вещество распределяется между двумя фазами – подвижной (жидкий или газообразный элюент) и неподвижной (жидкий или твердый сорбент). Различные компоненты смеси по-разному взаимодействуют с адсорбентами, позволяя сделать точные выводы о количественном и качественном составе смеси.

Впервые метод был описан в 1903 году Михаилом Цветом для разделения растительных пигментов. Впоследствии методика совершенствовалась многими учеными, и сегодня активно используется для исследования полезных ископаемых, в установках по определению качества и опреснения воды, на фармакологических, химических и пищевых производствах. Широкое распространение хроматография получила в медицине, где она применяется для диагностики заболеваний за счет обнаружения различных биохимических маркеров в физиологических жидкостях. В этой статье мы рассмотрим основные медицинские и фармакологические задачи, которые помогает решить хроматографическое оборудование.

Классификация видов хроматографии

Особенности хроматографического процесса зависят от того, какой вид методики используется в конкретном случае. Метод классифицируется по свойствам элюента, способу перемещения сорбатов и некоторым другим характеристикам. Рассмотрим наиболее популярные классификации.

По физической природе

По физической природе подвижной и неподвижной фаз выделяют следующие виды хроматографии:

• жидкостную – в качестве подвижной фазы используется жидкий растворитель;
• газовую – носителем анализируемого вещества выступает газ.

При этом жидкостная хроматография подразделяется на твёрдо-жидкофазную и жидко-жидкофазную, а газовая – на газоадсорбционную, газожидкостную и газораспределительную. В медицине используются все вышеперечисленные виды. К примеру, с помощью жидкостных исследований можно обнаружить свободные аминокислоты в крови и лимфе, а с помощью газовых – определить концентрацию токсинов в тканях пациента.

По технике выполнения

По технике выполнения методики подразделяются на:

• колоночную – неподвижная фаза помещается в колонку;
• плоскостную (бумажную и тонкослойную) – разделение происходит на поверхности специальной бумаги или тонком слое сорбента, нанесенном на пластинку;
• капиллярную – смесь разделяется на плёнке жидкости или поверхности сорбента в трубке.

В отдельную категорию выделают так называемую хроматографию в полях, в ходе которой разделение вещества происходит под действием магнитного поля, центробежной силы или других физических сил.

По способу перемещения разделяемой среды

Ещё одна классификация описывает хроматографическую методику по способу перемещения разделяемой среды вдоль сорбента:

• Элюентная или проявительная. Подготовленная проба вводится в колонку, перемещается в элюенте и разделяется на адсорбенте. Разная скорость сорбции обуславливает разную скорость выхода отдельных компонентов смеси из колонки.
• Фронтальная. Проба подается на сорбент постоянным потоком, то есть по сути является подвижной фазой.
• Вытеснительная. Методика аналогична проявительной, но при этом элюент не применяется. Часть веществ лучше взаимодействует с твердой фазой, за счет чего вытесняются соединения, менее склонные к сорбции. В результате смесь делится на составляющие.

Отдельно выделяют электрохроматографию, в которой движение соединений происходит за счет приложения направляющих сил (электрического тока). В медицине наиболее оправдано применение проявительной (элюентной) методики, поскольку она позволяет получить точные данные о составе многокомпонентного соединения.

Применение газовой хроматографии в медицине

На протяжении долгого времени эта методика применялась в медицине с некоторыми ограничениями. Ученые объясняли это тем, что биологические жидкости не обладают необходимой летучестью и мало устойчивы к физико-химическим воздействиям, из-за чего сложно получить точный результат. Но с совершенствованием газохроматографической методики и хроматографов, это ограничение удалось преодолеть.

Сегодня с ее помощью определяют:

• Концентрацию различных биологических маркеров в крови, лимфе, слюне;
• Степень очистки и качество выпускаемых лекарственных препаратов;
• Метаболизм различных биологически активных веществ в теле пациента.

Подробнее рассмотрим наиболее распространенные примеры применения методики в медицине.

Анализ жирных кислот

Для идентификации штамма патогенных микроорганизмов используется метод посева, при котором образец помещают в питательную среду и ждут развития колонии бактерий. Минус такого анализа заключается в его длительности: требуется не менее двух суток, чтобы точно определить вид патогена.

Газовая хроматография позволяет определить возбудителя по жирным кислотам, содержащимся в микробных клетках и их метаболитах. Липидные соединения в мембранах бактерий специфичны. Благодаря этому данный метод можно применять для ускоренной идентификации штамма микроорганизмов.

Пиролиз микроорганизмов

Ещё один способ, позволяющий точно установить вид бактерий, – это изучение газообразных продуктов пиролиза (термического разложения). При нагреве микроорганизмов выделяется смесь газов, которая уникальна для каждого штамма. Этот метод дает возможность исследовать образующиеся соединения и в результате идентифицировать микробы.

Экстракция компонентов микробных клеток

Компоненты клеточных структур и мембран различных микроорганизмов уникальны. С помощью газохроматографического исследования можно не только выявить патоген, но и поставить диагноз.

Наиболее показательными являются липиды, углеводы и жирные кислоты, содержащиеся в микробных клетках. В практической медицине они исследуются для:

• ускоренной постановки диагноза «газовая гангрена»;
• обнаружения метаболических нарушений в теле пациента;
• контроля над эффективностью лечения дисбактериоза и других заболеваний желудочно-кишечного тракта;
• диагностики пероксисомных нарушений;
• контроля над состоянием диабетиков и лиц, получивших сильные ожоги.

В исследовательской медицине такой анализ применяется для более глубокого понимания метаболических процессов, протекающих в клетках живых организмов. Например, с помощью этого метода был детально изучен атеросклероз и выработаны наиболее эффективные схемы его лечения и профилактики.

Определение лекарственных и наркотических средств

Хроматографический анализ используется также для обнаружения некоторых лекарственных и наркотических препаратов, например, барбитуратов. Для определения этой группы седативных средств применяется несколько методик. К примеру, можно использовать готовые формы медикаментов либо предварительно получать их производные. Выбор метода зависит от конкретной цели лабораторного сотрудника и имеющегося у него оборудования.

Чаще всего для определения барбитуратов в физиологических жидкостях человека выбирается газохроматографическая колоночная методика, но также может применяться высокоэффективная жидкостная хроматография.

Ещё один класс препаратов, определяемых с помощью хроматографов, — трициклические антидепрессанты. Их назначают при лечении психических расстройств и депрессий. Изучение концентрации данных веществ в крови пациентов позволяет скорректировать медикаментозную терапию и оценить ее эффективность.

Применение хроматографов оправдано и для обнаружения следующих средств:

• антиконсульванты;
• бензодиазепины;
• противоопухолевые препараты.

В отдельную категорию исследований выделяют обнаружение наркотиков в образцах мочи. Хроматографические методики используются для скрининга в физиологических жидкостях наркотических препаратов, что является неотъемлемой частью программы по профилактике и лечению наркомании в стране.

К преимуществам метода относится:

• высокая скорость получения результата;
• возможность обнаружения биологических маркеров и лекарственных препаратов в микроскопических концентрациях;

Жидкостная хроматография в медицине

При проведении медико-биологических исследований применяется не только газовая, но и жидкостная хроматография. Наиболее часто используются следующие ее разновидности:

• Аффинная. Метод, эффективный для обнаружения ферментов и вирусов. В качестве сорбента обычно используется гелеобразное вещество наподобие агарозы. Пробу с анализируемым составом пропускают через колонку с сорбентом, который удерживает и концентрирует фермент. Разделение по аффинной методике основано на специфических взаимодействиях: между ферментом и ингибитором, гормоном и рецептором и так далее. Уникальность метода заключается ещё и в том, что он позволяет выявлять целые клетки.
• Эксклюзионная. Метод основан на способности молекул разного размера заполнять собой поры геля. Анализируемое вещество вместе с подвижной фазой движется вдоль сорбента внутри колонки. Небольшие молекулы постепенно заполняют сорбент, тогда как крупные выходят вместе с элюентом. Применение эксклюзионного хроматографического метода в медицине и биологии оправдано для фракционирования вирусов и субклеточных частиц, очистки белков, и при контроле над радиоактивными метками.
• Ионообменная. Методика основана на различной способности ионов к ионному обмену. Некоторые частицы удерживаются на неподвижной фазе за счет возникающих электростатических сил, другие остаются в элюенте, за счет чего и происходит разделение многокомпонентной смеси. Ионообменный метод применяется для анализа нуклеиновых кислот, обнаружения радиоизотопов, токсинов в физиологических жидкостях.
• Тонкослойная. Основывается на многократном пересечении молекулами пробы границ между подвижной и неподвижной фазами, в результате чего и происходит разделение. Долгое время тонкослойный метод был наиболее часто применяемым в медицине для исследования структуры белков и нуклеиновых кислот. Сейчас он также широко используется благодаря простоте и дешевизне.

Точность хроматографического анализа во многом определяется правильным выбором подвижной и неподвижной фаз, тщательной подготовкой пробы, настройками и возможностями самого оборудования. Поэтому так важно, чтобы исследование проводили опытные специалисты на современных хроматографах.

Перспективы применения

Постоянное совершенствование хроматографических методик позволяет утверждать, что применение газовых хроматографов в медицине станет ещё более востребованным в ближайшие годы. Данный метод незаменим для обнаружения и анализа метаболических сред (крови, лимфы, мочи, выдыхаемого воздуха). Хроматограф позволяет полностью изучить состав каждой такой биологической среды и обнаружить в ней вирусы, бактерии, продукты распада наркотических или лекарственных препаратов, следы ядов.

Однако хроматографический анализ в медицине необходим не только для диагностики заболеваний. Он также позволяет контролировать ход лечения, выявлять реакцию пациента на введенные медикаменты и корректировать терапию, исходя из полученных данных. Если вы хотите больше узнать о возможностях современных газовых хроматографов, то свяжитесь со специалистами компании «Мета-хром» по контактному телефону, указанному на сайте.

Источник

Хроматографические методы анализа

Хроматография применяется для анализа сложных многокомпонентных смесей. Хроматографические методы определяют качественный и количественный состав органических веществ, включая летучие углеводороды и биологические жидкости. Фармацевтика, медицина, нефтеперерабатывающий комплекс, химическое производство и другие промышленные отрасли используют хроматографы для контроля качества сырья и готовой продукции, а также обеспечивают с их помощью соблюдение норм экологической безопасности.

Широкое распространение хроматографических методов анализа обусловлено их разнообразием и спецификой, которые раскрываются в данной статье:

Общие сведения о хроматографии

Хроматографические методы анализа основаны на цикличных актах сорбции‑десорбции, происходящих между подвижной фазой (элюентом) с растворенной пробой и неподвижным сорбентом. Компоненты сложных смесей имеют различную сорбируемость, и проходя вдоль неподвижной фазы, поглощаются с неодинаковой скоростью и в разном количестве. Последующее изучение результатов и их сравнение с эталоном позволяет установить точный состав реактива.

В традиционном методе в качестве неподвижной фазы используется материал с развитой поверхностью, а элюентом выступает поток инертного газа или жидкости. Фильтрация элюента через слой сорбента запускает многократное повторение сорбции и десорбции, что и отличает хроматографические методы анализа от других аналитических методик и обуславливает их эффективность.

Качественный и количественный анализ

Хроматографические методы анализа устанавливают качественный и количественный состав вещества. При качественных испытаниях пробу идентифицируют по ее хроматограмме, сравнивая полученные параметры с эталонными значениями, хранящимися в библиотеке данных.

Количественный метод анализа строится на измерении пиков, формирующихся в зависимости от концентрации примесей. Лаборант изучает хроматограмму одним из следующих методов:

• Метод абсолютной градуировки. Зависимость параметров пика от концентрации разных веществ определяется экспериментально. Затем составляются графики и таблицы, с которыми в последующем и сравнивается хроматограмма. Благодаря простоте и высокой точности, метод является основным для выявления микропримесей.
• Метод внутренней нормализации. Сумма выбранных пиковых параметров (например, их высота или площадь) принимается за 100%. Далее рассчитывается отношение высоты отдельного изучаемого пика к суммарному значению, благодаря чему определяется массовая доля конкретного компонента в пробе.
• Метод внутреннего стандарта. В смесь вводится стандартное вещество, для которого заранее известен калибровочный график. Затем пики изучаемых компонентов сравниваются с пиками «стандарта». Метод применяют в случае исследования составов с переменным, но известным количеством анализируемых компонентов.

Методы постоянно дорабатываются и совершенствуются, что позволяет получать более точные данные при анализе сложных смесей и нивелировать шумы на хроматограммах.

История возникновения метода

Впервые хроматография была описана русским ученым Михаилом Цветом, изучавшим строение хлорофилла. Ботаник предположил, что зеленый пигмент состоит из нескольких отдельных компонентов и нуждался в методе, который позволил бы разделить вещество на составляющие. Для этого он пропустил экстракт хлорофилла через стеклянную колонку, заполненную толченым мелом. Промыв сорбент эфиром, ученый получил несколько зон разного цвета, что позволило подтвердить многокомпонентный состав пробы. Разработанный метод был назван хроматографией.

Цвет описывал принцип хроматографии следующим образом: вещество в подвижной фазе постоянно реагирует с новыми участками адсорбента и частично впитывается, но при этом адсорбированные компоненты «вымываются» свежими порциями поступающего элюента. То есть, ученый открыл только один метод взаимодействия разделяемых компонентов: молекулярную адсорбцию.

Из‑за этого ботаник ошибочно предположил, что основным условием для осуществления хроматографического анализа является разница в адсорбируемости отдельных компонентов. Однако в современной хроматографии помимо молекулярной адсорбции для изучения сложных смесей используются и другие физико‑химические явления. В результате появилось множество хроматографических методов, и для их разграничения была разработана общепринятая классификация.

Классификация хроматографических методов анализа

Хроматографические методы разделяются на несколько групп в зависимости от сравниваемых параметров. По агрегатному состоянию фаз хроматографические методы анализа делятся на:

• Газожидкостные. Подвижной фазой служит поток инертного газа, который проходит через жидкий сорбент.
• Газоадсорбционные. Проба в газообразном состоянии пропускается через твердое вещество, на поверхности которого осуществляется адсорбция.
• Жидкостно‑жидкостные. В качестве элюента и неподвижной фазы используются жидкие среды.
• Жидкостно‑адсорбционные. Реагент подается вместе с растворителем и проходит через твердый пористый материал.
• Жидкостно‑гелевые. В этом методе неподвижная фаза представлена гелеобразным веществом.

Вторая классификация касается конструкции хроматографического оборудования. В большинстве методов применяется колоночный хроматограф: адсорбция осуществляется в колонках, заполненных неподвижной фазой. Но иногда используется плоскостная хроматография, в которой используется тонкий срез сорбента или специальная бумага. Также в последнее время получили распространение капиллярный хроматографический метод, при котором разделение происходит в пленке жидкости, и хроматография в полях, требующая для проведения анализа создания дополнительных магнитных, центробежных или иных сил.

Хроматографические методы анализа отличаются особенностями взаимодействия элюента и адсорбента. По механизмам разделения хроматография делится на:

• адсорбционную — основывается на разнице в адсорбируемости компонентов пробы;
• распределительную — протекает за счет различной растворимости веществ в фазах;
• ионообменную — осуществляется благодаря достижению констант ионообменного равновесия;
• проникающую — строится на разнице в формах и размерах молекул;
• осадочную — происходит благодаря осаждению нерастворимых соединений;
• адсорбционно‑комплексообразовательную — выполняется за счет образования на поверхности неподвижной фазы координационных соединений разной прочности.

Следующая классификация разделяет хроматографические метода анализа на три группы по способам перемещения поглощаемых компонентов вдоль адсорбционного слоя. Выделяют проявительный (или элюентный), фронтальный и вытеснительный методы. Рассмотрим их подробнее.

Методы перемещения пробы в неподвижной фазе

К наиболее простым хроматографическим методам анализа относится фронтальный, при котором роль элюента сведена к минимуму. Предположим, что проба представляет собой растворитель Solv, в котором содержатся два компонента: A и B. Анализируемое вещество непрерывным потоком пропускается через сорбционную колонку. После прохождения через хроматографическое оборудование, измеряется концентрация A и B в выходном растворе и учитывается изначальный объем Solv. На основании полученных данных строится график зависимости, который и является выходной кривой (хроматограммой).

Из‑за поглощения неподвижной фазой компонентов A и B, из колонки сначала будет поступать растворитель, затем вещество с меньшим коэффициентом сорбции (допустим, A), и только потом B. В результате спустя некоторое время из хроматографического оборудования будет поступать раствор с неизменным составом (одинаковой пропорцией Solv, A и B). Данный хроматографический метод анализа применяется не только для изучения сложных веществ, но и для их очистки от примесей, при условии, что они поглощаются лучше, чем основные элементы реагента.

В лабораторных испытаниях чаще всего используется проявительный или элюентный хроматографический метод. Специалист добавляет в колонку пробу реагента Solv c растворенными в нем компонентами A и B, после чего под постоянным давлением подает подвижную фазу. Под воздействием физико‑механических сил происходит разделение состава. Вещество с лучшей сорбируемостью займет верхнюю часть колонки, с меньшей — нижнюю. На выходе из оборудования сначала появится компонент A, затем чистый Solv, потом — элемент B, что и отразится в хроматограмме. Количественный анализ проводится измерением высоты и площади пиков: чем они больше, тем выше концентрация изучаемого вещества в составе.

Главное преимущество элюентного хроматографического метода заключается в возможности разделения сложных многокомпонентных реактивов. Однако при изучении хроматограммы необходимо учитывать снижение концентрации выходящих растворов из‑за разбавления подвижной фазой.

Третий метод — вытеснительный. Он предполагает использование вытеснителя (препарата D), который постоянно воздействует на раствор Solv, введенный в хроматографическую колонку. Коэффициент сорбции D должен быть выше, чем у любых компонентов анализируемой пробы. Благодаря этому препарат постепенно вытесняет вещество с худшей сорбируемостью, что и фиксируется при выходе смеси из колонки. Вытеснительный метод не требует применения газа‑носителя, в результате чего сокращаются издержки на проведение исследований. Однако стоит помнить, что анализ полученных данных затрудняется из‑за наложения зон разных веществ друг на друга, поскольку они не разделяются зоной растворителя.

Метод газожидкостной хроматографии

В аналитической химии широко используется газожидкостный хроматографический метод. Благодаря разнообразию применяемых жидких неподвижных фаз, можно создать оптимальные условия для идентификации практически любого вещества, содержащегося в исследуемой пробе в незначительной концентрации. Это обуславливает универсальность метода. Для этого необходимо правильно настроить хроматографическое оборудование и подобрать неподвижную фазу, отвечающую следующим параметрам:

• высокая способность к растворению элементов, содержащихся в реактиве — в противном случае проба быстро выходит из колонки и не дает достаточный материал для проведения анализа;
• низкая летучесть — во время исследования фаза не должна испаряться, поскольку это осложнит чтение хроматографического графика;
• химическая инертность — адсорбент не должен вступать в реакции с компонентами пробы или газом‑носителем;
• минимальная вязкость — в противном случае замедлится диффузия.

Также для реализации метода важна максимальная разделительная способность компонентов конкретной пробы.

Помимо выбора жидкой среды, в которой будет происходить разделение смеси на отдельные составляющие, во время подготовки хроматографического анализа необходимо подобрать носитель неподвижной фазы. В качестве носителя используется твердый и прочный материал, на котором жидкость образует тонкую однородную пленку. Чаще всего применяется силанизированный хромосорбат, фторуглеродные полимеры и гранулы из высококачественного стекла. Данные носители отличаются следующими преимуществами:

• легко и равномерно смачиваются неподвижной фазой;
• практически не впитывают жидкость, то есть не препятствуют нормальному протеканию реакции между жидкой и газообразной средами;
• не реагируют на повышение температуры в рабочей колонке.

Хроматографические методы анализа, построенные по газожидкостному принципу, относятся к наиболее современным, и применяются в случае необходимости разделения веществ, относящихся к одному классу. Их активно используют в химической и нефтегазовой промышленности для контроля над качеством получаемой продукции. Среди ключевых преимуществ газожидкостного метода анализа можно выделить:

• экспрессность;
• максимальная точность;
• полная автоматизация;
• небольшие затраты на подготовку пробы и проведение исследования.

Для использования метода требуется подобрать не только жидкую среду и ее носитель, но и решить вопрос с непрерывной подачей элюента. Для минимизации расходов к хроматографу подключается генератор газа (например, водорода), который продуцирует нужное количество вещества и отвечает за его равномерную подачу в оборудование.

Жидкостно‑жидкостный хроматографический метод

По технологии выполнения жидкостно‑жидкостный хроматографический метод анализа похож на газожидкостную хроматографию. На твердый носитель наносится жидкая среда, выступающая в роли неподвижной фазы. Для подготовки пробы используется не инертный газ, а раствор.

Изучаемый реагент вместе с потоком жидкого растворителя движется через сорбент, на поверхности которого происходит разделение компонентов. Чаще всего неподвижной фазой заполняют колонку хроматографа, но для некоторых исследований прибегают к методу тонкослойной хроматографии, при котором адсорбентом смачивают специальную бумагу.

Разделение осуществляется за счет распределения веществ между несмешивающимися растворами. То есть, концентрация одного и того же вещества в подвижной и неподвижной фазах будет различаться и зависеть от коэффициента распределения. Значения коэффициента устанавливаются эмпирически для каждого компонента, в результате чего жидкостно‑жидкостные хроматографические методы анализа позволяют с высокой точностью идентифицировать отдельные элементы в сложном составе.

Для успешной реализации метода необходимо правильно выбрать несмешивающиеся фазы. Обычно они подбираются исходя из опыта прошлых анализов. Чаще всего применяются так называемые «тройные системы», в которые включены два несмешивающихся друг с другом растворителя и третья жидкость, растворимая в обеих фазах. Например, это может быть система из несмешивающихся гептанов и воды, в которую вводится хорошо растворимый в обеих средах этанол.

При выборе составов для подвижной и неподвижной фаз, следует учитывать, что их нерастворимость друг в друге относительна, и при проведении исследования вещества будут вступать во взаимодействие (пусть и в незначительном объеме), что сказывается на значениях, которые показывают хроматографические методы анализа. Для минимизации погрешности используется одна из двух технологий: предварительное насыщение подвижной фазы неподвижной или химическое закрепление жидкости на сорбенте.

Эффективность проведенного хроматографического анализа зависит также от выбора носителя для неподвижной фазы. Требования к нему следующие:

• развитая поверхность;
• химическая инертность;
• высокая способность к удержанию жидкости;
• устойчивость к используемым растворителям.

Чаще всего в жидкостно‑жидкостных хроматографических методах исследования в качестве носителя выбирается целлюлоза, фторопласт, силикатные гели или полимеры.

Метод распределительной бумажной хроматографии

Помимо вышеописанных носителей, заполняющих колонки, в распределительных хроматографических методах анализа может использоваться специальная бумага, на которой происходит разделение исследуемых компонентов. Данный метод редко применяется в промышленных масштабах (по сравнению с колоночной хроматографией), но достаточно часто используется в аналитической химии.

Технология проведения бумажного хроматографического анализа предполагает вычисление коэффициента Rf, представляющего собой отношение смещения зоны компонента к смещению фронта раствора. В теории коэффициент зависит только от исследуемого вещества, растворителя и параметров бумаги. Однако в действительности при реализации метода на коэффициент также влияют компоненты, присутствующие в пробе в микроконцентрации, и используемая техника. В результате возникает определенная погрешность, которую необходимо учитывать при расшифровке анализа.

Распределительные хроматографические методы анализа чувствительны к характеристикам используемой бумаги. Она должна соответствовать следующим критериям:

• химическая чистота;
• нейтральность;
• инертность по отношению к реагентам в пробе;
• однородность.

При подборе материала учитывается также ориентация волокон, качество целлюлозы, сорбируемость. Параметры определяют скорость движения раствора и осаждения обнаруживаемых молекул.

В бумажном методе есть еще один нюанс — некоторые вещества могут поменять свойства носителя с гидрофильных на гидрофобные, что полностью нарушит ход эксперимента. В таком случае хроматографическая бумага предварительно пропитывается парафином или растительными маслами.

Растворители в распределительном методе

Большое влияние на точность хроматографических методов анализа оказывает выбранный растворитель. В качестве подвижной фазы необходимо взять жидкость, которая в меньшей степени растворяет обнаруживаемые компоненты, чем неподвижная фаза. Если пренебречь данным условием, метод не сработает: при слишком высокой растворимости проба пройдет вместе с жидкостью, не адсорбируясь на поверхности, при слишком низкой — останется на начальной линии и не даст требуемую для расшифровки градацию.

Если с помощью распределительного метода анализируется водорастворимая смесь, в качестве неподвижной фазы берется очищенная вода, в качестве подвижной — любой удобный органический растворитель. Выбранные жидкости не должны смешиваться, менять свои свойства в процессе исследования, важна их доступность и нетоксичность для человека.

Распределительные хроматографические методы анализа основаны на использовании смешанных фаз: смесей спиртов друг с другом и органическими кислотами, аммиаком, водных растворов фенола или крезола и так далее. Меняя концентрацию, насыщенность и пропорции в растворе удается плавно менять коэффициент Rf, создавать оптимальные условия для анализа, и получать дополнительные данные при расшифровке хроматограммы.

Как и прочие хроматографические методы анализа, бумажная хроматография определяет и качественный, и количественный состав пробы. В первом случае изучается специфическая окраска пятен на хроматограмме и анализируется числовое значение Rf для каждого обнаруживаемого реактива.

Для определения количественного состава смеси исследуется площадь образовавшихся пятен, интенсивность их окраски. Также применяют метод вымывания, при котором каждое цветовое пятно обрабатывают экстрагентом и затем подсчитывают количество вымытого вещества.

Тонкослойный хроматографический метод

Хроматографические методы анализа отличаются информативностью, сложностью проведения и актуальностью для решения практических промышленных задач. Одним из самых распространенных является метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), разработанный группой ученых в 1938 году.

Твердая фаза наносится тонким слоем на специально подготовленную стеклянную, металлическую или пластиковую пластину. Затем на ее край лаборант вносит анализируемую пробу и погружает пластинку в жидкий растворитель, выступающий в качестве подвижной фазы. Под действием капиллярных сил исследуемый состав начинает двигаться по сорбенту, разделяясь на свои компоненты. Диффузия в твердом неподвижном слое происходит в двух направлениях: продольном и поперечном, что дает дополнительные сведения для анализа.

Особенность хроматографического метода заключается в относительной простоте исполнения. Для проведения эксперимента требуются:

• Пластинки для твердого адсорбента. Обычно подложки изготавливаются из алюминиевой фольги, полимерной пленки или стекла.
• Сорбент. Чаще других в данном методе применяются сорбенты из силикагеля, крахмала и целлюлозы.
• Растворитель. Выбор подвижной фазы зависит от физико‑химических свойств твердого вещества и исследуемых реагентов. Как и в бумажном методе, допустимо использование многокомпонентных жидкостей.

После окончания работы перед построением хроматографического графика пластинку опрыскивают проявляющим реактивом либо подвергают воздействию ультрафиолета. Затем приступают к определению компонентов пробы и их дальнейшему изучению любым удобным для лаборанта методом.

Качественные и количественные методы анализа в ТСХ

Для качественного исследования пробы одним из самых надежных и показательных является «метод свидетелей». Вместе с составом на линию старта наносятся индивидуальные вещества («свидетели») — предполагаемые компоненты смеси. На все жидкости влияют одинаковые силы, поэтому совпадение коэффициента Rf одного из «свидетелей» с компонентом реагента позволяет предположить наличие в пробе данного вещества.

Что касается количественных определений в данном методе, то они выполняются непосредственно на пластине либо уже после снятия с нее слоя сорбента. В первом случае измеряется площадь цветового пятна и с помощью заранее подготовленного графика вычисляется количество вещества.

Однако более показательным считается спектрофотометрический метод. Сорбент удаляется с пластинки и помещается в специальное оборудование, которое и показывает процентное содержание различных компонентов с высокой точностью.

Ионообменный хроматографический метод

Метод ионообменной хроматографии основан на замене элементарных частиц, входящих в реактив, на атомы, содержащиеся в ионообменнике. Поэтому результативность анализа зависит от параметров используемого оборудования. Современные ионообменники обладают важными преимуществами:

• Высокая обменная емкость.
• Воспроизводимые ионообменные свойства.
• Устойчивость к воздействию кислот и щелочей, любых сильных окислителей.

Для их производства чаще всего используются различные полимерные соединения: например, полистирол с разным набором функциональных групп, определяющим характерные свойства готового материала.

Ионообменный хроматографический метод применяется преимущественно для разделения элементарных частиц, после которого можно провести количественный подсчет анализируемых компонентов. Данная технология используется для обнаружения разнообразных анионов в питьевой и технической воде, продуктах переработки, пищевом, фармацевтическом и химическом сырье. Наиболее показателен метод для определения катионов щелочных и щелочноземельных металлов, и замещенных солей аммония.

Перспективы развития хроматографических методов

Хроматографические методы анализа постоянно совершенствуются и модифицируются. Появляются новые технологии, позволяющие определять компоненты смеси в наноконцентрациях. Благодаря этому удается повысить качество готовой продукции в различных отраслях промышленности, минимизировать экологические риски за счет установления жесткого контроля над составом сточных вод.

Однако возможности хроматографии ограничены не только применяющимися методами, но и используемым оборудованием. Важно, чтобы хроматографы отвечали следующим требованиям:

• Простая подготовка и введение проб.
• Быстрое получение результатов и легкая расшифровка хроматографических графиков.
• Принцип работы, основанный на передовых методах.
• Максимальная точность анализа.
• Нивелирование погрешностей, возникающих из‑за физико‑химических свойств используемых подвижных и неподвижных фаз.
• Минимальные затраты на ввод оборудования в эксплуатацию и его дальнейшее обслуживание.
• Возможность анализа сырья или продукции без прерывания основного технологического процесса.
• Определение широкого спектра соединений, включая летучие углеводороды и другие сложные для обнаружения вещества.
• Быстрое обучение персонала методам работы с лабораторным оборудованием.

Дальнейшее совершенствование хроматографов позволит удешевить хроматографические методы анализа и расширить области их применения. Именно к этому и стремится компания ООО «НПФ Мета‑хром». Мы предлагаем высококлассное оборудование, соответствующее всем стандартам качества. Узнать подробную информацию о методах работы на хроматографах можно у менеджеров по контактному телефону компании или с помощью формы обратной связи в разделе «Контакты».

Источник